Manual de Procedimientos Basicos para Diagnostico de Leishmaniasis Tegumentaria Americana (LTA) en el Instituto de Investigaciones de Enfermedades Tropicales (IIET)

  • Posted on: 5 October 2018
  • By: admin_iiet

INTRODUCCIÓN:

La Leishmaniasis Tegumentaria Americana es una enfermedad producida por parásitos de género Leishmania capaces de infectar al ser humano. La provincia de Salta forma parte de la zona endémica de la Argentina para leishmaniasis. El departamento de Orán reporta anualmente el 53% de todos los casos del país. La microscopía es el método más empleado en la diagnostico de pacientes que concurren al Instituto de Investigación de Enfermedades Tropicales (IIET), el presente Manual expone otros métodos utilizados en este Instituto para la detección de esta infección, para optimizar el diagnóstico de la leishmaniasis con la finalidad de que el paciente inicie el tratamiento correspondiente

DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS EN EL IIET

En el presente documento figuran los principios, las metodologías y las interpretaciones básicas de las pruebas diagnósticas utilizadas en el Instituto de Investigaciones de Enfermedades Tropicales, para realizar el diagnostico de Leishmaniasis Tegumentaria Americana (LTA).

FROTIS DE LESIONES:

Este método directo permite observar al microscopio amastigotes de Leishmania presentes en lesión, los cuales varían según el tiempo de evolución y la forma clínica de la enfermedad. La muestra de lesión se obtiene mediante la escarificación del borde de la lesión, empleando un palillo de madera con un extremo en forma de bisel; la muestra se la extiende en forma de improntas en dos portaobjetos y se tiñe con colorantes panópticos (Giemsa al 10% durante 20’), para su observación al microscopio óptico. La detección de parásitos en lesiones crónicas típicas de Leishmaniosis cutánea localizada es más difícil que en lesiones recientes, donde se observan una mayor cantidad de parásitos que hacen más fácil su diagnóstico. La sensibilidad de este método en el diagnóstico de leishmaniosis cutánea varía entre 32,7% y 90,4%, la cual se ve afectada por varios factores como la cantidad de número de muestras a analizar, el personal de toma de muestra y el lugar de la lesión del cual se toma la muestra ( centro o borde de la lesión), la experiencia del microscopista y la calidad de los reactivos utilizados.

Procedimiento:

  1.- Realizar la limpieza de la lesión utilizando Gasa con agua con jabón, y/o solución fisiológica estéril.

  2.- Si hay costra removerla cuidadosamente y limpiar nuevamente con agua y jabón para retirar los excesos de sangre que se presenten.

  1. -Con el borde en forma de bisel del palillo, realice suavemente un raspado sobre el punto elegido para la toma de la muestra, (siempre un mismo borde de la lesión).
  2. -La muestra obtenida del raspado se extiende sobre una lámina de vidrio previamente desengrasada.
  3. Se preparan 2 portaobjetos, en cada lámina debidamente rotulada se pueden realizar 3 o 4 improntas o frotis.
  4. Dejar secar las láminas a temperatura ambiente.
  5. Fijar con metanol durante 1 o 2 minutos.
  6. Realizar la coloración con Giemsa (dilución 1:10), durante 20 minutos.
  7. Cumplido el tiempo de coloración enjuagar suavemente el portaobjetos con agua.
  8. Dejar secar a temperatura ambiente.
  9. Realizar la lectura en el microscopio óptico utilizando el objetivo de 100X. Identificar el estadio de amastigote: formas redondeadas u ovaladas que presentan un núcleo y un Kinetoplasto (como una barrita) en su citoplasma, estas estructuras toman una coloración lila, (según fotografía). Los parásitos son intracelulares, pero por la manipulación en el proceso de la toma de muestra es posible que los macrófagos se rompan por lo que se pueden observar formas extracelulares libres.

 

CULTIVO DE LEISHMANIA:

Preparación del medio de cultivo BIFASICO:

FASE SOLIDA: Preparar el agar de la siguiente forma: pesar 4 gramos de agar base (DIFCO u otro de muy buena calidad) y disolverlo en 100 ml de agua destilada, luego se esteriliza en autoclave, a 121 °C de temperatura y 1 atmósfera de presión durante 15 minutos, posteriormente el medio estéril se enfría en baño maría a 45 °C. En el interior de una campana de flujo laminar, Se agrega 20 ml de sangre de conejo desfibrinada al medio de cultivo, mezclar bien.

Distribuir de 2 a 3 ml de la mezcla a tubos de 10 ml con tapa de goma previamente esterilizados; y se deja enfriar en soportes formando un ángulo de 25°, a fin de obtener los medios de cultivo en forma de pico de flauta. El medio así preparado se conserva hasta el momento de utilizar en un refrigerador a 4 °C, pero no por más de 15 días.

Dos tubos se colocan en estufa a 37° C para control de esterilidad y también 2 tubos se inoculan con promastigotes de Leishmania como control de calidad de los medios de cultivo.

FASE LIQUIDA: PBS + ANTIBIOTICOS: 1 ml de una mezcla de antibióticos (penicilina G sódica 3.000 UI y Sulfato de estreptomicina 3.000 ug).

 

Aislamiento primario de las lesiones cutáneas:

Previamente, es crucial un riguroso proceso de asepsia y limpieza de las lesiones. Esto va íntimamente relacionado con los problemas de contaminación por otros microorganismos. La super­ficie del área a ser trabajada es limpiada, de manera sistemática y en forma secuencial, con: agua y jabón neutro, y finalmente agua o solución fisiológica estéril. Este ritual ayudará a dis­minuir significativamente la contaminación bacteriana y fúngica.

Para la toma de muestra, se utiliza la técnica de aspirado del borde de las lesiones, con una jeringa de 10mL, y una aguja de mayor calibre, 23 G. El vehículo será 0,3 a 0,5 ml de PBS estéril más ATB (penicilina + estreptomicina).

Con la jeringa cargada con solución de PBS + ATB. Introducir la aguja en el sitio elegido comenzando desde la parte sana de la piel y llegando hasta la proximidad del borde de la lesión, introducir parte del líquido y luego haciendo rotar la jeringa varias veces mientras se está dentro de la piel, este procedimiento, cortará pequeñas piezas de tejido con los bordes de la aguja, luego retirar el líquido inoculado previamente, de esta forma se aspira tanto fluido tisular y piezas de tejido cómo es posible, rotando, tirando y soltando el émbolo con suavidad.

Posteriormente se saca la jeringa y se inocula 0,5 ml en el tubo con medio de cultivo sólido, para este proceso es importante utilizar la misma aguja, de manera que con el liquido restante en la jeringa se arrastre restos de tejido que hayan quedado en el interior de la aguja.

Se repite este procedimiento con otros dos tubos, se rotulan con el número correspondiente al paciente y fecha de inoculación; para posteriormente incubarlos entre 22 y 25°C en una estufa refrigerada.

La muestra también puede ser obtenida a través de una biopsia («punch»), y posteriormente triturada con la ayuda de un «tissues grinder», en una solución de suero fisiológico y antibióticos (penicilina y estreptomicina). Algunas gotas de este homogenizado serán inoculadas en los tubos de cultivo.

Es importante señalar que la excesiva presencia de san­gre en las muestras es perjudicial para el desarrollo del parásito. Según Evans, la sangre contiene proteínas séricas; altamente inhibitorias para el crecimiento de los promastigotes de Leishmania.

La lectura de los tubos se realiza cada 7 días durante 21 días. Para la lectura de los tubos y los cultivos se utiliza una campana de flujo laminar vertical.

Con una jeringa y aguja se mezcla el sobrenadante del tubo con medio de cultivo, se extrae una gota de la fase liquida y se coloca entre portaobjetos y cubriendo con un cubreobjetos de 20 x 20 mm y se observa en un microscopio (OLYMPUS CH-30) con objetivos 40 X.

También es posible realizar la verificación del crecimiento de los promastigotes de Leishmanias, utilizando un microscopio invertido, de manera de no tener que destapar los tubos con las siembras a los fines de evitar contaminaciones.

Los promastigotes de Leishmanias obtenidos mediante el cultivo se pueden utilizar para las siguientes técnicas:

  • Representan los antigenos para pruebas serológicas como ELISA e Inmunofluorescencia Indirecta (IFI).
  • Son expuestos a medios de cultivos enriquecidos (medio liquido LIT suplementado con 10% de suero fetal bovino) para producir cultivos en masa es decir mayor cantidad de promastigotes que luego serán utilizados para producir Leishmanina (Antígeno), para la prueba Intradermo Reacción de Montenegro.
  • Son expuestos en FTA-CARDS para enviar a Laboratorios especializados de Referencia, con el fin de determinar Especies y Genotipos de Leishmanias, mediante la identificación por análisis de Electroforesis de enzimas múltiples locus.

 

INTRADERMOREACCION DE MONTENEGRO

La prueba intradérmica (IDR) de Montenegro, mide la reacción de hipersensibilidad cutánea (RHC) de tipo retardada a antígenos homólogos o heterólogos de promastigotes de Leishmania, es una prueba útil en el estudio clínico y epidemiológico de la leishmaniosis tegumentaria de las Américas.

Es una prueba que mide la reacción de hipersensibilidad retardada, demostrando si el paciente tiene o ha tenido contacto previo con protozoarios del género Leishmania. La reacción se produce luego de la inoculación del antígeno Leishmanina en la cara anterior del antebrazo, pasado un tiempo entre 48 a 72 horas se manifiesta una induración con edema y enrojecimiento en el sitio de la inoculación demostrando un resultado positivo si el diámetro de esta induración es igual o mayor a 5 mm. La sensibilidad de esta técnica supera el 93% pero hay que tomar en cuenta que los resultados demostrados por esta técnica no diferencian si la infección es reciente o pasada, o, en otras palabras, solo indica que existe respuesta inmune celular por contacto con el parasito.

PREPARACIÓN DEL ANTIGENO LEISHMANINA:

La leishmanina, es un extracto soluble del parasito. En nuestro laboratorio se utilizan formas promastigotes de las cepas de L.(br) brasiliensis, autóctonas de nuestra región que son identificadas por análisis de Electroforesis de enzimas múltiples locus, en el Instituto de Patología Experimental (IPE) Universidad Nacional de Salta.

Los promastigotes fueron cultivados en forma sucesiva en los medios de agar sangre bifásico suplementado con un 20% de sangre desfibrinada de conejo (USMARU) y el medio liquido LIT suplementado con 10% de suero fetal bovino, cosechados en la fase logarítmica de crecimiento, centrifugados a 3500 rpm por 15 minutos a 4°C y lavados 3 veces con solución salina 0,89%. Subsecuentemente, se realizó una dilución con una concentración de 10⁶ Promastigotes por ml de una solución de fenol al 5‰. La solución, fue centrifugada a 3.000 rpm por 15 minutos a 4°C. El sobrenadante obtenido, solución antigénica, fue esterilizada mediante filtros Millipore de 0,22 µm y almacenados a -20° hasta su uso. Para garantizar la esterilidad e inocuidad del antígeno, se realiza el estudio microbiológico en placas de agar sangre y Sabouraud e incubados a 37°C por 30 días.

APLICACIÓN DEL ANTIGENO (PRUEBA DE MONTENEGRO):

Se aplica vía intradérmica 0,1 ml la leishmanina preparada, en la cara anterior del antebrazo del paciente, se debe observar que al momento de colocar se forme una pequeña pápula, lo que indica que la administración fue en forma intradérmica.

Se indica al paciente que esa pápula se desarma sola en algunas horas y que puede presentarse prurito en la zona de inoculación por lo que se recomienda no rascarse. Luego citar al paciente al laboratorio a las 48 o 72 horas para la lectura de la reacción.

LECTURA DE LA REACCION: La lectura de la reacción de hipersensibilidad se verifica, según patrón establecido, entre las 48 y 72 horas posteriores a la aplicación.

La prueba se considera positiva si el diámetro promedio de la induración (pápula) es ≥ a 5 mm en el sitio de la inoculación. Para ello tanto el diámetro mayor como su perpendicular son medidos y promediados; utilizando un bolígrafo que delimita la pápula luego medir registrándose el resultado obtenido en mm.

ENSAYO INMUNOENZIMATICO

Métodos indirectos como los inmunoensayos y en particular las pruebas de ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) pueden ser una alternativa complementaria valiosa para el diagnóstico de la LTA dado el bajo costo, la rapidez de los resultados, la elevada sensibilidad y la posibilidad de un procesamiento masivo de muestras. Complementariamente, este hecho facilita la realización de estudios epidemiológicos a gran escala e incluso podría actuar como prueba de screening.

Además, estas herramientas inmunoenzimatica podrían ser usadas en el seguimiento serológico del tratamiento de la LTA, dado que se ha observado un descenso significativo en los niveles de anticuerpos después del tratamiento en pacientes con LC.

Antes del empleo de las técnicas inmunoenzimatica (ELISA) el diagnóstico de la leishmaniosis estaba restringido al diagnóstico clínico y parasitológico. Actualmente se emplean proteínas totales como antígenos para el diagnóstico inmunológico encontrando anticuerpos circulantes para los diferentes tipos de enfermedad, y alcanzando una sensibilidad del 92% y una especificidad limitada del 65% debido a las reacciones cruzadas que presente esta parasitosis con Tripanosoma cruzi.

OBTENCION DE LOS SUEROS:

Se extrae sangre venosa utilizando jeringa 10 ml y agujas 25:8; en tubos de hemolisis; se deja retraer el coagulo en baño de agua a 37°C; se centrifuga a 3.000 rpm durante 5 a 10 minutos; se separan los sueros en crio tubos de 2 ml; una alícuota con el agregado al 50% de glicerina, y el otro tubo sin glicerina. Correctamente rotulados con el Número correspondiente al paciente y fecha de extracción, Se guardan en freezer -70°C hasta su uso.

OBTENCION DE LOS ANTIGENOS:

Se desarrollan inicialmente en un medio de cultivo bifásico (USMARU modificado), formas promastigotes de L (V) brasiliensis; L (L) amazonenses y L (V) guyanensis. Este medio consiste en una fase solida de agar base sangre con 20% de sangre de conejo desfibrinada y hemolizada, y solución PBS como fase liquida. Luego, para la obtención del cultivo masivo, se transfieren los parásitos a un medio liquido (RPMI 1640 con bicarbonato de sodio, L- glutamina, suero bovino fetal al 10 o 20% y penicilina – estreptomicina). Una vez obtenido 50 ml de un cultivo bien desarrollado, los parásitos (promastigotes en fase estacionaria) son concentrados por centrifugación a 5000 rpm durante 10 minutos y lavados 3 veces con PBS-BSA (buffer fosfato salino albumina de suero bovino). El pellet de parásitos es sometido a lisis usando un buffer de lisis (Tris base 50 mM pH 8, EDTA 1 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM y triton x 100 0,1%) diluido con solución de sacarosa. Este lisado es centrifugado a 20000 rpm por 60 minutos a 4°C obteniéndose la fracción soluble de proteínas en el sobrenadante, el cual es cuantificado por medio del método de Bradford y conservado a -20°C hasta su uso.

Antes de procesar las muestras, se evalúan los buffers carbonato (pH 9,6) y buffer fosfato salino (pH 7,2) como disolventes para la adhesión de los antígenos a las placas (sensibilización) y se realiza una titulación con tres diluciones de suero (1:20; 1:40; 1:80) y dos diluciones de (1:10000 y 1:20000) de anti Ig G conjugada con peroxidasa a los fines de obtener valores de densidad óptica (DO) apropiados. Este procedimiento de titulación permite reducir el efecto de background y lograr una mejor discriminación entre los sueros controles negativos y positivos.

Luego de la elección de concentraciones y buffers, se aplicaron las técnicas de ELISA usando independientemente como antígeno sensibilizante de placas, 2 ug/100 ul pocillo de Homogenado proteico de promastigotes de L (V) brasiliensis (ELIS Ab), L (L) amazonensis (ELISA a) y L (V) guyanensis (ELISA g) diluidos en PBS, e incubados toda la noche a 4°C. Los sitios inespecíficos fueron bloqueados con PBS-leche descremada al 5% durante 1 hora a temperatura ambiente, luego y previo lavado con PBS-Tween al 0,1% se agregaron los sueros en una dilución 1:40 en PBS-leche al 1% con una hora de incubación.Cumplido el tiempo se lavan las placas cuidadosamente con el mismo buffer de lavado y se agrega el conjugado diluido 1:10000 en PBS-Tween 0,05%. El tiempo de reacción del conjugado fue de una hora a temperatura ambiente, lavándose la placa al concluir el tiempo de aplicación con PBS-Tween al 0,1%. La reacción fue visualizada agregando dihidrocloruro de orto-fenilendiamina y H2O2 al 30%, diluidos en buffer citrato (pH 5,3). Se deja reaccionar 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, deteniéndose la reacción con ácido sulfúrico 2M. Todos los sueros son analizados por duplicado y los valores de DO son determinados mediante un lector de ELISA a 490 nm. El cutt off es seleccionado mediante el análisis de curvas ROC (Receiver Operator Characteristic) y las zonas de indeterminación son calculadas como el ± 10% de dichas líneas de corte.